蜜蜂黑蜂王台病诊断技术规范
蜜蜂黑蜂王台病诊断技术规范
1 范围
本规范规定了黑蜂王台病的诊断、疫情处理、预防等技术措施。
本标准适用于辽宁省蜜蜂黑蜂王台病的防治。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修定单）适用于本文件。
GB3095环境空气质量标准
NY5027无公害食品 畜禽饮用水水质
NY 5139—2002无公害食品 蜜蜂饲养管理准则
NY5138 无公害食品 蜜蜂饲养兽药使用准则
DB21/T 1645-2008蜜蜂防疫技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本规范。
3.1 黑蜂王台病
黑蜂王台病是由黑蜂王台病毒引起的蜜蜂传染性病毒病。
3.2 蜂群
以群体为单位，由蜂王、工蜂、雄蜂组成的能独立生活的蜜蜂群体。
3.3 子脾
巢房内以卵、幼虫、封盖蛹为主的巢脾。
4 诊断
依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化、实验室检验等可做出判断。
4.1流行特点
在蜂王幼虫的巢房里，死亡的幼虫为黑色，其巢房也为深黑色，现在发现其蜂群常年易感染本病，成蜂和幼虫均可感染，染病的幼虫呈现灰黄色，然后呈囊状型，常年以隐性感染状态流行于蜂群中，只是春、秋季更加严重。
本病的主要传播途径是蜂群间通过蜜蜂的寄生性病原，如螨和微孢子虫，同一蜂群内，成蜂通过螨及微孢子虫，将病毒传染给健康蜜蜂及幼虫，导致幼虫及成蜂患病。
4.2 临床症状
黑蜂王台病主要感染4～5日龄幼虫，现在成蜂与幼虫均感染该病毒，且无明显的症状，只有感染该病毒的蜂王才可能会致死，大多死于封盖后期，而感染初期的幼虫为淡黄色，继而呈囊状型。体色由珍珠白变淡黄，继而变深黄、深黑。
4.3临床诊断
4.3.1箱外观察 正常情况下从工蜂体外并无异样，无明显的疾病症状；但是对于蜂王幼虫可见其黑或黑褐色。
4.3.2开箱检查 打开蜂箱，提出子脾，如果发现巢脾下边有王台，发现其颜色暗褐色，可初步确认。
4.3实验室诊断
4.3.1电镱检查 取病死幼虫，加等量0.03M磷酸缓冲液和1/4体积四氯化碳，研磨、匀浆。经超速离心机差速和蔗糖蜜度梯度离心提取，纯化。用提取物制备电镜片，置电镜下观察，有许多圆形病毒颗粒，可初步确诊为病毒，仍需进一步分析与鉴定。
4.3.2血淋巴诊断 应用免疫琼脂双扩散反应和对流免疫电泳法，进行抗原、抗体反应制备标准黑蜂王台病抗体和待检测病蜂血淋巴，取病虫组织液，经4000 rpm离心15min，取上清液为检测样品（抗原），若采用琼脂免疫扩散或对流免疫电泳关检测，若出现白色沉淀，即为阳性，感病；无沉淀线产生即为阴性，健康。
4.3.3 聚合酶链式反应扩增（RT-PCR）
4.3.3.1 Trizol试剂法
通过采集带有明显发黑或塌陷的王台病症状的蜂王幼虫或成蜂，将其病样溶于RNA提取试剂TRIzol中。
4.3.3.1.1 在上述小管中加入1mL Trizol 充分混匀，室温孵育5分钟；
4.3.3.1.2 12000 g，4°C离心10min，小心吸出上清液加入新管中；
4.3.3.1.3 在上述1.5 mL小管中加入200 μL三氯甲烷，震荡小管15 s，管内液体变为粉红色，室温静置3 min；
4.3.3.1.4 12000 g，4 °C离心15 min，小心吸取上清液加入新管中；
4.3.3.1.5 在上述1.5 mL小管中加入500 μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min；
4.3.3.1.6 12000 g，4 °C离心10 min，弃去上清液，沉淀即为RNA；
4.3.3.1.7 使用1mL 75%乙醇洗涤沉淀；
4.3.3.1.8 7500 g，4 °C离心10 min，弃去上清液，干燥5-10 min；
4.3.3.1.9 加入30 μL RNase-free water于上述离心管中，55 °C水浴5-10 min，直至RNA充分溶解；
4.3.3.1.10取1.5 μL RNA溶液，使用NanoDrop测定浓度及质量，确保OD260/280都在1.8以上；
4.3.3.1.11用50ul 无菌水，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，贮存于-20℃备用。
4.3.3.2 RT-PCR
根据反转录试剂盒的步骤，得到第一链cDNA。根据第一链及设计的相应引物，进行ＰＣＲ扩增，其反应条件如下：首先94℃预变性3min；接着PCR进行30-35个循环，循环条件为94℃/30ｓ，55℃/40ｓ，72 ℃/1 min；最后72 ℃延长10 min。扩增产物用1.2％ 琼脂糖凝胶电泳检查，当电泳产物出现与目标大小一致的条带，且唯一一条，而阴性样品无条带，则证实已检测到目标病毒。
5 疫情处理
根据流行病学特点、临床症状，结合实验室检测做出的诊断结果可作为疫情处理的依据。
5.1 发现疑似黑蜂王台病疫情时，养殖户应立即将病蜂王台毁掉，如果严重应立即更换新王。当地动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实，包括流行病学调查、临床症状检查、采集病料、实验室诊断等，根据诊断结果采取相应措施。
5.1.1隔离条件
发现有蜂群感染黑蜂王台病，应立即将病群隔离。同时对所有蜂群进行检查，根据检查结果分别处理。
5.1.2病群 将确诊患黑蜂王台病的蜂群转移到5公里以外，不易扩散病原体，便于消毒处理的地方隔离治疗，病群的蜂机具、蜂产品等未经处理，不得带回健康蜂场。
5.1.3疑似患病群
将疑似病群另外安置一远离健康群的场所，或更换新王，或隔离观察。
5.1.3假定健康群
将假定健康群于原地或另搬一场所进行观察。
5.1.4隔离解除
隔离的病群治愈后，经一个月的观察期再无复发，即可解除隔离。
5.2消毒
5.2.1消毒要求
病群、疑似病群和假定健康群都要进行消毒处理。消毒内容包括蜂机具、蜂脾、蜂体和工作服。
按NY 5139—2002无公害食品 蜜蜂饲养管理准则有关规定进行。
5.3 扑杀，当蜂群发病严重，难以维持生存时，养殖者应将蜂群销毁，以防其传染。
5.4 无害化处理
对所有病死蜂采取焚烧后掩埋；对于被病蜂污染的蜂箱、巢脾等蜂机具可采用消毒方法进行处理。
6 黑蜂王台病的预防
6.1 蜂场环境
6.1.1 蜂场地势高燥、能满足蜂群摆放、背风向阳、安静、小气候良好。
6.1.2 蜂场周围空气质量符合GB3095空气质量功能区二类区要求。
6.1.3 水源充足，水质符合NY5027中幼畜禽的饮用水标准。
6.1.4 隔离条件 平原地区至少在半径 5 公里以上，山区至少在3公里以上无西方蜜蜂饲养场。
6.2 蜂场卫生要求
6.2.1 保持蜂场清洁，每周清理 1 次蜂场死蜂和杂草，清理的死蜂及时深埋；蜂场周围环境至少每季用5%的漂白粉乳剂喷洒或生石灰消毒一次。
6.2.2 蜂箱、隔板等每年至少消毒 1 次。巢脾、饲喂器、脱粉器、起刮刀、割蜜刀、蜂扫等工具在使用前、后要洗刷干净并消毒。工作服每周清洗消毒 1 次。
6.2.3 所选用的消毒剂必须对人、蜂安全，无残留毒性，对蜂机具无破坏性。
6.3蜂群管理
6.3.1 饲喂蜂群的蜂蜜、糖浆、花粉或花粉代用品要保证品质并经消毒灭菌处理。不用被蜜蜂病原体污染的饲料喂蜂。
6.3.2 不从疫区引进蜂种或到疫区放蜂。
6.3.3 在早春和晚秋繁殖期，加强蜂群保温，保持蜂脾相称或蜂多于脾。
6.4 药物预防
6.4.1 在整个繁殖和生产期之前，每个月用金银花等中草药预防一到三次。
6.4.2 在春、夏、秋三个季节，每个季度用抗病毒一号预防二次。
6.5 引种检疫
国内异地引入蜜蜂蜂群或蜂王，应取得原产地动物防疫监督机构的检疫合格证明。到达引入地后，种蜂必须隔离饲养一月以上，并由引入地动物防疫监督机构进行检测，合格后方可混群饲养。
1 范围
本规范规定了黑蜂王台病的诊断、疫情处理、预防等技术措施。
本标准适用于辽宁省蜜蜂黑蜂王台病的防治。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修定单）适用于本文件。
GB3095环境空气质量标准
NY5027无公害食品 畜禽饮用水水质
NY 5139—2002无公害食品 蜜蜂饲养管理准则
NY5138 无公害食品 蜜蜂饲养兽药使用准则
DB21/T 1645-2008蜜蜂防疫技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本规范。
3.1 黑蜂王台病
黑蜂王台病是由黑蜂王台病毒引起的蜜蜂传染性病毒病。
3.2 蜂群
以群体为单位，由蜂王、工蜂、雄蜂组成的能独立生活的蜜蜂群体。
3.3 子脾
巢房内以卵、幼虫、封盖蛹为主的巢脾。
4 诊断
依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化、实验室检验等可做出判断。
4.1流行特点
在蜂王幼虫的巢房里，死亡的幼虫为黑色，其巢房也为深黑色，现在发现其蜂群常年易感染本病，成蜂和幼虫均可感染，染病的幼虫呈现灰黄色，然后呈囊状型，常年以隐性感染状态流行于蜂群中，只是春、秋季更加严重。
本病的主要传播途径是蜂群间通过蜜蜂的寄生性病原，如螨和微孢子虫，同一蜂群内，成蜂通过螨及微孢子虫，将病毒传染给健康蜜蜂及幼虫，导致幼虫及成蜂患病。
4.2 临床症状
黑蜂王台病主要感染4～5日龄幼虫，现在成蜂与幼虫均感染该病毒，且无明显的症状，只有感染该病毒的蜂王才可能会致死，大多死于封盖后期，而感染初期的幼虫为淡黄色，继而呈囊状型。体色由珍珠白变淡黄，继而变深黄、深黑。
4.3临床诊断
4.3.1箱外观察 正常情况下从工蜂体外并无异样，无明显的疾病症状；但是对于蜂王幼虫可见其黑或黑褐色。
4.3.2开箱检查 打开蜂箱，提出子脾，如果发现巢脾下边有王台，发现其颜色暗褐色，可初步确认。
4.3实验室诊断
4.3.1电镱检查 取病死幼虫，加等量0.03M磷酸缓冲液和1/4体积四氯化碳，研磨、匀浆。经超速离心机差速和蔗糖蜜度梯度离心提取，纯化。用提取物制备电镜片，置电镜下观察，有许多圆形病毒颗粒，可初步确诊为病毒，仍需进一步分析与鉴定。
4.3.2血淋巴诊断 应用免疫琼脂双扩散反应和对流免疫电泳法，进行抗原、抗体反应制备标准黑蜂王台病抗体和待检测病蜂血淋巴，取病虫组织液，经4000 rpm离心15min，取上清液为检测样品（抗原），若采用琼脂免疫扩散或对流免疫电泳关检测，若出现白色沉淀，即为阳性，感病；无沉淀线产生即为阴性，健康。
4.3.3 聚合酶链式反应扩增（RT-PCR）
4.3.3.1 Trizol试剂法
通过采集带有明显发黑或塌陷的王台病症状的蜂王幼虫或成蜂，将其病样溶于RNA提取试剂TRIzol中。
4.3.3.1.1 在上述小管中加入1mL Trizol 充分混匀，室温孵育5分钟；
4.3.3.1.2 12000 g，4°C离心10min，小心吸出上清液加入新管中；
4.3.3.1.3 在上述1.5 mL小管中加入200 μL三氯甲烷，震荡小管15 s，管内液体变为粉红色，室温静置3 min；
4.3.3.1.4 12000 g，4 °C离心15 min，小心吸取上清液加入新管中；
4.3.3.1.5 在上述1.5 mL小管中加入500 μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min；
4.3.3.1.6 12000 g，4 °C离心10 min，弃去上清液，沉淀即为RNA；
4.3.3.1.7 使用1mL 75%乙醇洗涤沉淀；
4.3.3.1.8 7500 g，4 °C离心10 min，弃去上清液，干燥5-10 min；
4.3.3.1.9 加入30 μL RNase-free water于上述离心管中，55 °C水浴5-10 min，直至RNA充分溶解；
4.3.3.1.10取1.5 μL RNA溶液，使用NanoDrop测定浓度及质量，确保OD260/280都在1.8以上；
4.3.3.1.11用50ul 无菌水，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，贮存于-20℃备用。
4.3.3.2 RT-PCR
根据反转录试剂盒的步骤，得到第一链cDNA。根据第一链及设计的相应引物，进行ＰＣＲ扩增，其反应条件如下：首先94℃预变性3min；接着PCR进行30-35个循环，循环条件为94℃/30ｓ，55℃/40ｓ，72 ℃/1 min；最后72 ℃延长10 min。扩增产物用1.2％ 琼脂糖凝胶电泳检查，当电泳产物出现与目标大小一致的条带，且唯一一条，而阴性样品无条带，则证实已检测到目标病毒。
5 疫情处理
根据流行病学特点、临床症状，结合实验室检测做出的诊断结果可作为疫情处理的依据。
5.1 发现疑似黑蜂王台病疫情时，养殖户应立即将病蜂王台毁掉，如果严重应立即更换新王。当地动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实，包括流行病学调查、临床症状检查、采集病料、实验室诊断等，根据诊断结果采取相应措施。
5.1.1隔离条件
发现有蜂群感染黑蜂王台病，应立即将病群隔离。同时对所有蜂群进行检查，根据检查结果分别处理。
5.1.2病群 将确诊患黑蜂王台病的蜂群转移到5公里以外，不易扩散病原体，便于消毒处理的地方隔离治疗，病群的蜂机具、蜂产品等未经处理，不得带回健康蜂场。
5.1.3疑似患病群
将疑似病群另外安置一远离健康群的场所，或更换新王，或隔离观察。
5.1.3假定健康群
将假定健康群于原地或另搬一场所进行观察。
5.1.4隔离解除
隔离的病群治愈后，经一个月的观察期再无复发，即可解除隔离。
5.2消毒
5.2.1消毒要求
病群、疑似病群和假定健康群都要进行消毒处理。消毒内容包括蜂机具、蜂脾、蜂体和工作服。
按NY 5139—2002无公害食品 蜜蜂饲养管理准则有关规定进行。
5.3 扑杀，当蜂群发病严重，难以维持生存时，养殖者应将蜂群销毁，以防其传染。
5.4 无害化处理
对所有病死蜂采取焚烧后掩埋；对于被病蜂污染的蜂箱、巢脾等蜂机具可采用消毒方法进行处理。
6 黑蜂王台病的预防
6.1 蜂场环境
6.1.1 蜂场地势高燥、能满足蜂群摆放、背风向阳、安静、小气候良好。
6.1.2 蜂场周围空气质量符合GB3095空气质量功能区二类区要求。
6.1.3 水源充足，水质符合NY5027中幼畜禽的饮用水标准。
6.1.4 隔离条件 平原地区至少在半径 5 公里以上，山区至少在3公里以上无西方蜜蜂饲养场。
6.2 蜂场卫生要求
6.2.1 保持蜂场清洁，每周清理 1 次蜂场死蜂和杂草，清理的死蜂及时深埋；蜂场周围环境至少每季用5%的漂白粉乳剂喷洒或生石灰消毒一次。
6.2.2 蜂箱、隔板等每年至少消毒 1 次。巢脾、饲喂器、脱粉器、起刮刀、割蜜刀、蜂扫等工具在使用前、后要洗刷干净并消毒。工作服每周清洗消毒 1 次。
6.2.3 所选用的消毒剂必须对人、蜂安全，无残留毒性，对蜂机具无破坏性。
6.3蜂群管理
6.3.1 饲喂蜂群的蜂蜜、糖浆、花粉或花粉代用品要保证品质并经消毒灭菌处理。不用被蜜蜂病原体污染的饲料喂蜂。
6.3.2 不从疫区引进蜂种或到疫区放蜂。
6.3.3 在早春和晚秋繁殖期，加强蜂群保温，保持蜂脾相称或蜂多于脾。
6.4 药物预防
6.4.1 在整个繁殖和生产期之前，每个月用金银花等中草药预防一到三次。
6.4.2 在春、夏、秋三个季节，每个季度用抗病毒一号预防二次。
6.5 引种检疫
国内异地引入蜜蜂蜂群或蜂王，应取得原产地动物防疫监督机构的检疫合格证明。到达引入地后，种蜂必须隔离饲养一月以上，并由引入地动物防疫监督机构进行检测，合格后方可混群饲养。
邮箱: service@46659.com QQ群：46591971